NDV长春株和四平株HN/F核酸疫苗的构建及表达
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摘要：将新城疫病毒（NDV）长春株和四平株和HN和F基因插入pIRES1多克隆位点（EcoRV）中构建成成核酸表达疫苗pIRcHN和pIRsHN，然后将pIRcHN和pIRsHN的新霉素基因切除，将长春株和四平株的的F基因分别插入其中，构建成pIRcHNF和pIRsHNF，构建的核酸表达质粒分别转染Hela细胞，经血凝效价测定、Western blot分析，结果表明，长春株构建的核酸疫苗的血凝活性比四平株高一个数量级，Hela细胞表达的HN蛋白量以pIRcHN最高，pIRsHN次之，pIRcHNF和pIRsHNF较低。将重组疫苗转染Hela细胞，用兔抗鸡IgY进行间接免疫荧光试验，结果：在细胞膜和细胞浆中观察到了特异性的黄绿色荧光，表明表达产物是特异的。nU ~ {.Gt*_y Kem+E0
X@g"M_9s0关键词：NDV HN基因 F基因 核酸疫苗"gn Xt4l9@z0
.x;];_!~+g%[J!dw5?0NDV是副病毒科腮腺病毒属的成员，所有的NDV都含有6种病毒特异性结构蛋白，即：L、NP、HN、F、M、P，其中，HN具有使病毒体吸附于细胞受体（神经氨酸），并通过血凝素和神经氨酸酶这两种生物活性破坏这种受体的功能，而F蛋白则参与病毒的穿入，细胞融合、溶血等过程。通过NDV毒力的分子基础分析，证明HN和F糖蛋白均为重要宿主保护性免疫原。[1，2]近年的研究表明，NDV的HN基因具有去除肿瘤细胞表面唾液酸的作用，[3]因此，HN和F基因的研究对HN基因疫苗和NDV抗肿瘤的研究具有重要的意义。中国宠物医师网%~wy@c
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8U"v$f6Y6]7W01． 材料和方法
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1.1 主要材料 NDV四平株（强毒）、长春株（弱毒）的HN和F基因由丁壮和王兴龙经PCR获得。Bluescript KS(-)、pIRES1质粒、大肠杆菌DH5α、Hela等由本室保存。限制性内切酶、T4DNA连接酶等均购自Takara公司。8a)k8u"l-w+L%H'P(u0
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1.2 DNA操作，包括感受态细胞的制备、质粒或连接物的转化、质粒小量制备及酶切鉴定、质粒的大量提取与纯化等均按常规方法进行。中国宠物医师网XBvm4iMz
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1.3 核酸疫苗在Hela细胞中的表达 E oz6B!t0
.Y8d.Bi"dF;t^ U d01.3.1 体内重组：重组质粒用脂质体法转染Hela细胞：即于60×30mm培养板中接种Hela细胞1×105-2×105/ml，在500ul RPMI 1640中，加入10ul DoTAP，轻轻混匀，另取500ul RPMI 1640 加入重组质粒20ug混匀，温育30分钟，然后将后者滴加于前一液体中，混匀，室温下作用30分钟。将上述混匀液加入Hela细胞中共转染。中国宠物医师网q V,Akt z!S#N
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1.3.2 表达产物SDS-PAGE和Western blot检测，按常规方法进行。中国宠物医师网4f1sx J@S8i"G+q
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1.3.3 表达产物的血凝试验：按《动物病毒学》上的方法进行。中国宠物医师网q;\ ?;O1[i U7sQK-o
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|5Ia'\01.3.4 间接免疫荧光鉴定HN和F蛋白的表达 取适量的重组细胞，接种于飞片上，同时用正常细胞做对照，待凉干后，用PBS（PH7.2）洗一次，用10%丙酮固定10-15分钟，PBS冲洗后，与NDV的阳性血清反应用2小时，PBS洗涤3次，然后与异硫氰酸荧光黄（FITC）标记的羊抗鸡IgY反应2小时，PBS洗涤3-5次，将载有细胞的飞片倒置于载玻片上，于荧光显微镜下观察和拍照。中国宠物医师网'~ny)S
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本研究为国家“973”资助项目。编号为：G199011902中国宠物医师网p9T%Y,DL'q
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第一作者简介：龚伟, 男 , 37岁, 博士后、副教授，主要从事分子生物学研究J,c*I\.I0
:|&d T-[$]0h`{~&G02．结果9x c:sn ad/tv i0
0L E!s@O j{*o02.1 pIRHN/F和pIRHNF表达质粒的构建 分别将含有NDV长春株和四平株HN基因片段插入真核表达载体pIRES1的多克隆位点，将pIRES1的新霉素基因切去，将F基因插入其中。中国宠物医师网&E
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d+H)h Aj/`t0以NheI和BamHI消化pIRHN，正向连接可获得1.6kb和5.38kb两个片段。以EcoRI消化pIRHNF，正向连接可获得138，455，2265和4995bp的两个片段。中国宠物医师网.r#eExh
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2.2 表达产物的血凝效价`&PT ^$DiS1U0
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核酸疫苗的表达产物均具有血凝活性，且由长春株HN表达的产物的血凝活性比四平株HN的血凝活性高一个数量级。中国宠物医师网[ N*w(Z-^ Q
]4Z,?C y/I3[m02.3 重组质粒表达产物的检测/iyav%e1gAc}0
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可以看出长春株pIRcHN的表达量最高，四平株pIRsHN的表达量次之，长春株pIRcHNF和四平株pIRsHNF的表达量较低。中国宠物医师网W!^r/U2X
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gX02.4 间接免疫荧光鉴定中国宠物医师网&Mt7LX"y0d$I(J
Wtt%m-^[3Vl0结果显示，各重组质粒转染的Hela细胞均出现特异性黄绿色的荧光（结果未完全显示），特异性荧光的主要分布在细胞膜，细胞浆仅有少量分布，正常Hela细胞未出现特异性荧光，呈阴性反应。T"d$[ wBt)wd"\6s0
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3．讨论0`R fl~P4x`TZ0
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3.1 PIRHN /PIRHNF结构分析中国宠物医师网$|mlV|"pSL
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核酸疫苗是将作为免疫原的一种或多种蛋白编码基因克隆到真核表达载体上，将构建的重组质粒直接导入体内，通过宿主细胞的转录系统合成目的蛋白抗原，因此要求载体质粒即能在真核细胞内高效表达而又不复制。本实验所采用的载体质粒pIRES1neo，它的启动子和增强子来源于在真核细胞中具有较大活性的人巨细胞病毒（CMV）直接早期区，在多克隆位点和新霉素抗性基因（neo）之间有一个来源于脑心肌炎病毒的核糖体结合位点（IRES），这一元件能使来源于同一mRNA的两个开放读框正确表达。因此我们将长春株或四平株的HN基插入多克隆位点（EcoRV）,将neor全基因序列切除，加入长春株或四平株的F基因，保证HN和F基因都能表达。这样质粒通过宿主细胞合成的目的蛋白抗原，可诱导宿主产生对抗该抗原蛋白的免疫应答，从而达到预防和治疗疾病的目的[4,5]，具有良好的应用前景。s$I Z Co.D2v0
4H)h-k9yWMh$I0NDV功能性表面糖蛋白基因（HN和F基因）是构建NDV致病力的分子基础[6,7]。NDV的F和HN糖蛋白已在痘苗病毒、鸡痘病毒（FPV）、鸽痘病毒（PPV）和杆状病毒载体系统获得了表达，而有关NDV HN和F的核酸疫苗的报道较少[8,9]，到目前为止，尚未见到NDV强毒株和弱毒株的HN或F核酸表达疫苗进行比较以及在同一载体上表达HN和F蛋白的文献报道。本实验将构建的pIRcHN 、pIRsHN、 pIRcHNF、 pIRsHNF核酸疫苗转染Hela细胞，获得了正确表达。从表达产物的血凝活性和HN含量来看，长春株（弱毒株）高于四平株（强毒株），这为NDV疫苗的研究，以及利用NDV抗肿瘤研究打下了理论基础。o+f9zA)n#F0
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